引言慢性炎症性疾病，主要是其愈合的生理过程被破坏导致的。例如类风湿性关节炎，通常起病于青年阶段，自身无法有效终止炎症，进而导致了一些明显的组织破坏，如骨丢失，从而需要终身免疫抑制治疗。现有的治疗策略主要是以促炎因子为靶点抑制炎症，而不是促进消退。脂质递质如消退素涉及了炎症的消退，而其中的机制依然未知。这篇文章主要是从这个方面出发，明确了IL-9在关节炎消退中起到主要的调节作用，以及产生IL-9的II型固有淋巴细胞(ILC2)的在消退过程中的启动作用。概述1.IL-9缺陷小鼠的慢性关节炎?2.IL-9加速了炎症的消退?3.变化的17型辅助性T细胞和调节性T细胞在IL-9缺陷关节炎小鼠中的的反应?4.通过共刺激ICOSL-ICOS和GITRL-GITR，ILC2维持了调节性T细胞的抑制能力?5.IL-9在人关节炎消退中的作用

1.IL-9缺陷小鼠的慢性关节炎

作者通过在野生型和IL-9-/-小鼠身上构建抗原诱导性关节炎模型(AIA，关节腔下注射甲基化的牛血清白蛋白，其炎症可自发消退，常作为关节炎的标准模型)，可以观察到AIA在IL-9缺陷小鼠中表现为高度的慢性。其中，野生型的关节肿胀在12-16天内（从第21天算起）可自发消退，而IL-9缺陷小鼠则超过了42天也没有消退的迹象。这里以42天为界，是因为我们诊断类风湿性关节炎时，诊断标准中的病程通常考虑为至少6周，短时间存在的关节炎症状（如小于6周）很可能是由某种急性病毒性多关节炎引起而不是由RA引起。症状持续时间越久，RA的诊断越可能成立。

接下来，在第22天时，作者通过hydrodynamicgenetransfer(HDGT)的方法，利用微环的载体，来过表达IL-9（黑色组），其表型可以被挽救。Hydrodynamicgenetransfer(HDGT):鼠尾静脉注射外源性的质粒，在肝脏沉积后，表达，分泌。

组织形态学分析发现，在第42天时，IL-9缺陷小鼠的RA后的膝关节，依然存在持续性的滑膜炎（HE染色）、过度的软骨和骨退变（番红O染色，主要从炎症累积面积、蛋白多糖丢失、软骨细胞数量、软骨厚度的4个方面来展现），以及更多的破骨细胞（胫骨取材，统计了N.Oc/B.Pm单位骨的破骨细胞数量和Oc.S/BS单位骨表面的破骨占比）。这里的IL-9缺陷小鼠的control组的放大的图有点问题，可能是漏放了。

Micro-CT可以发现明显的骨小梁网状结构的丢失，以及骨量下降。此处最好可以有造模前的统计数据呈现。

作者向小鼠足垫皮下注射单钠尿酸盐的结晶来造痛风的模型，发现IL-9缺陷并不影响急性炎症的愈合。在这里排除了急性炎症，说明IL-9是在慢性炎症过程中起作用，而不是急性炎症。2.IL-9对慢性炎症的作用——加速消退

作者为了进一步研究IL-9的促进慢性炎症消退的治疗作用。又造了一个血清转移诱导性关节炎(SIA)的模型（其可以使炎症持续数周），依旧用了前述的HDGT方法，在SIA的效应期（诱导后的第3天），过表达了IL-9。结果与AIA模型一致：IL-9对炎症初期及炎症最严重时都没有很大的作用，而是在后期强烈地加速了消退。第9天时，过表达组(SIA+Il9MC)的炎症已经完全消退，而对照空载体组(SIA+ctrlMC)依然在加重。

组织形态学分析发现，第9天时，SIA+Il9MC组有着更少的滑膜炎，减少了组织损伤，保留了软骨的完整性，减少了破骨细胞的数量，降低了骨侵蚀。?左边图line1SIA+ctrlMC足垫肿胀明显，SIA+Il9MC则消退了；?line2关节的HE染色可以看到SIA+ctrlMC滑膜炎明显；?line3番红O染色看软骨（红色）和骨（蓝绿色）；?line4TRAP染色可以看到SIA+ctrlMC有较多的破骨，而SIA+Il9MC则明显减少了；?line5micro-CT，SIA+ctrlMC的白色箭头所指为骨侵蚀，SIA+Il9MC看起来没那么明显；?右边统计图，分别为炎症定量、软骨损伤和骨侵蚀。3.寻找IL-9促进关节炎消退的机制

作者在IL-9缺陷和野生型两种小鼠的AIA模型间，用ELISA分别分析了血清（系统性）、关节炎的关节（局限性）中的关键的促炎、抗炎因子的时间动力学。其中，tumornecrosisfactor(TNF)-α,IL-6,interferon(IFN)-γ,IL-2和IL-4没有显著区别。只有IL-17表现了在IL-9缺陷小鼠的显著的持续高表达，而在野生型中则降回到了基线水平。作者为什么选了这些细胞因子？查阅其他的一些文献，如果是和RA相关的并不单单是这些，还有IL-1家族成员：IL-1、IL-18和IL-33；集落刺激因子：GM-CSF和M-CSF；典型的Th2细胞因子IL-13和IL-4；IL-15；TGF-β等。一篇Review中的总结也可以参考：

作者可能应用了相应的抗体盒子，其中恰好包含了以上内容，当然做得更多会更全面。IL-17是由17型辅助性T细胞产生的一种促炎因子，而17型辅助性T细胞则是CD4+细胞的一种亚型。IL-17的选择性上调与17型辅助性T细胞极化有关。在人类滑膜组织培养物中，加入IL-17可增加IL-6生成和胶原破坏。暴露于IL-17可增加培养的成纤维细胞样滑膜(fibroblast-likesynovial,FLS)细胞和新收集的单核细胞表达环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)及生成前列腺素E2[3]。这种细胞因子还可减少骨质形成，并通过增强破骨细胞激活增加骨质吸收[4]。值得注意的是，很大一部分的滑膜IL-17A可能是由肥大细胞产生的[5]。

作者通过流式细胞术，比较了初始(CD62L+)、记忆(CD44high)和效应(CD44low)T细胞。重点可以看有显著性差异的组（尤其注意IL-9缺陷小鼠的炎症关节组），这里可以进一步认为，在缺陷小鼠中，17型辅助性T细胞持续驱动了免疫反应。

作者进一步猜测，IL-9有没有可能是17型辅助性T细胞分化的内源性的调节因子呢？在17型诱导性辅助性T细胞下，刺激CD4+T细胞，对比了两种小鼠间17型辅助性T细胞向传统方向或炎症性方向分化的比例，结果没有差异。因此可以认为，IL-9缺陷并没有造成17型辅助性T细胞的内源性损伤。但也提示了在IL-9引起的对17型辅助性T细胞极化的抑制中，还有其他类型的细胞起到了关键作用。

接下来作者用CFSE分析了在两种小鼠的调节性T细胞(CD4+CD25+Foxp3+)增殖，时间节点为第42天，也就是野生型炎症已经消退，而缺陷小鼠中仍然持续的时间点。这里作者想到IL-9的靶细胞可能是调节性T细胞的原因可能在于，有研究认为，17型辅助性T细胞与调节性T细胞是相关的，导致17型辅助性T细胞分化的信号，会抑制调节性T细胞的分化。[6]CFSE是一种细胞增殖检测，这种染料可以穿透细胞膜，内源性酶将其水解后，可以产生绿色荧光，但此时就不具备膜通透性了。当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。这种现象可以在nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。调节性T细胞的总数在组间没有发现明显差异。但是，将其与CFSE标记的效应性T细胞(CD25?Foxp3?)共培养，然后分析效应性T细胞的极化，发现在缺陷小鼠中，调节性T细胞的抑制能力明显降低。

缺陷小鼠的调节性T细胞的功能损伤，与一些效应分子的表达水平有着紧密的关系，例如Foxp3、共刺激受体GITR(Tnfrsf18)和ICOS。主要是GITR和ICOS有显著性差异。

同时，作者也通过了同样的方法，反向验证，排除了缺陷小鼠的效应性T细胞会有对抗调节性T细胞的效应。无论是h图的极化还是i图的细胞因子都没有差异。4.通过共刺激ICOSL-ICOS和GITRL-GITR，ILC2维持了调节性T细胞的抑制能力在体外，内源性IL-9可以温和地促进调节性T细胞的功能。作者没有放出数据，但也和之前的研究一致。

但是，用IL-9预先刺激来自缺陷小鼠的调节性T细胞，然后将这些细胞移植回缺陷小鼠身上，并没有发现可以防止AIA的慢性化。因此，作者需要继续寻找这其中的细胞中介。

作者在这里用了另外一种小鼠，IL-9citrinereportermice通过荧光染色标记了能够表达IL-9的细胞。继续用了流式的方法，根据viability,IL-9,CD45,lineagemarkers(Lin;CD3ε,CD11b,CD11c,CD45R,CD49b,FcER1a,Gr-1andTER-),ICOSandST2进行细胞分类。大部分产生IL-9的细胞并不表达谱系特殊标记lineage(Lin)，其中包括了潜在的产生IL-9的细胞类型，如9型辅助性T细胞和肥大细胞等。这里需要介绍一个概念：Lineage-positive(Lin+)cellsareamixofallcellsexpressingmaturecelllineagemarkers.Forexampleformousebonemarrow:Mac-1formyeloidcells,CD4andCD8forT-cells,CD19orBforB-cells,Ter-forerythrocytes,ect.Therestofthecellsarelineage-negative(Lin-)–theyarenotstainedbythelineageantibodies.AllstemandprogenitorcellactivitywasidentifiedwithingLin-population,butnotinLin+cells.超过80%的Lin-citrine+细胞表达了ST2,ICOS,CD25,CD90andSca-.而这些IL-9+的白细胞中，ILC2是在关节炎消退期产生IL-9的主要细胞，将近80%。需要注意的是，作者采集细胞的时间为第27天，这是介于炎症峰值和50%已经缓解中间的时间点。

通过免疫荧光标记的方法，再次验证了ILC2为产生IL-9的主要细胞。

而至于肥大细胞，作者比较了不同小鼠间炎症关节的相关基因表达水平，发现基本没有差异，就此排除了肥大细胞。

在初步确定了靶细胞为ILC2后，作者统计了ILC2在膝关节滑膜的数量，同时用Ki67共染色，来评估ILC2的极化情况。发现缺陷小鼠中ILC2的数量显著降低，由此认为可能是数量减少而造成了极化的损伤。ki67是一种核蛋白，可作为细胞极化的标记，与核糖体RNA转录有关，存在于G1,S,G2和分裂期，而细胞间期(G0)时则不存在。与先前的研究一致，ILC2中的IL-9通过自分泌的方式促进了ILC的极化。

用HDGT的方式过表达IL-25和IL-33（IL-25和IL-33可以直接活化ILC2），可见IL-9缺陷小鼠组和过表达组的显著差异，确认了缺陷小鼠的ILC2存在内源性损伤。额外的IL-9可以完全重建ILC2，所以后两组间可以没有显著差异。

通过彩色荧光显微镜观察炎症滑膜，可以看到产生IL-9（玫红色）的ILC2位于CD3+（蓝色）Foxp3+（红色）调节性T细胞的边上。根据ILC2和调节性T细胞的共定位，细胞的互相作用，猜想可能与抑制调节性T细胞的功能相关。

作者对比了有无IL-9的刺激，调节性T细胞受体相关配体GITRL和ICOSL的mRNA表达，确实看到了显著上调。

为了进一步确定ILC2和调节性T细胞间的互相作用，作者又做了在有或无ILC2条件下的调节性T细胞抑制试验。用的是抗GITRL或ICOSL的阻断抗体。当单独只有IL-9缺陷的调节性T细胞时，不能够抑制效应性T细胞的极化，而ILC2可以完全挽救IL-9缺陷的调节性T细胞的抑制能力。

作者做了Transwell，Il9-/-+ILC2s(transwell)组与Il9-/-(transwell)组间并没有显著差异，也就是达不到挽救效果，因此发现ILC2的中介作用，是需要直接的细胞接触的。这里的Transwell做的是共培养，在一定的孔径下，小室和培养板分别种两种细胞，它们不会互相接触，但其小室中细胞分泌或代谢的物质是可以影响培养板上的细胞的。再回到前面的e图，筛选了关于这个细胞接触的潜在中介，ILC2高表达GITRL或ICOSL，并已知它们可以促进IL-9缺陷的调节性T细胞的抑制能力。阻断了GITR–GITRL和ICOS–ICOSL后，ILC2在IL-9缺陷的调节性T细胞的抑制能力上的中介作用则颠倒了。

同前，在IL-9缺陷的调节性T细胞上的配体结合GITR和ICOS后，也可以恢复其抑制能力。

接下来作者又进行了体内试验，移植IL-9缺陷但已经被GITR和ICOS预先活化的调节性T细胞，可以看到它们又重新获得了抑制能力，这里也就意味着确认了ILC2在炎症消退中的作用。

移植ILC2进IL-9缺陷小鼠后，因为ILC2抑制了17型调节性T细胞（这里的17型调节性T细胞通过IL-17的血清水平来表现），也就促进了炎症的消退。

以上的机制可以用下面这张图来表示：[7]5.IL-9在人关节炎消退中的作用

最后作者呈现了人的滑膜组织数据，来说明IL-9和ILC2的作用。RA活动期滑膜IL-9的表达主要来源于Lin+细胞（与之前的研究一致）。相比之下，RA活动期的IL-9+ILC2较少；而在临床缓解期，则表现为较多的Lin-IL-9+ILC2和显著减少的Lin+IL-9+ILC2。而相比健康人，外伤后的急性关节炎仅表现为，Lin+IL-9+ILC2和Lin-IL-9+ILC2有升高的趋势。

作者又做了一个纵向的随访（从抗炎治疗起，6个月，也就是抗类风湿药开始起效至关节炎消退），发现IL-9的来源从Lin+IL-9+ILC2变为了Lin-IL-9+ILC2。

从前面的局限性炎症，到全身性，作者又呈现了血清数据，将RA患者以活动期和缓解期分组（主要是以DAS28评分2.6为缓解来界定），发现活动期ILC2较低，而缓解期较高；横坐标为DAS28，纵坐标为单位血的ILC2数量时，有一个显著的相关性。

同样，这个纵向的观察表现了ILC2与疾病活动程度的一个交互关系，主要是基线和随访(6-12个月)数据间对比，表现了一个起病、稳定缓解、诱导缓解、持续的炎症活动的4种过程。本研究的创新性Rauber等人扩宽了炎症损伤消退的概念，重新将细胞免疫学作为临床相关过程重要但未充分发掘的一部分，带回到大家的视野中。[7]在此研究的基础上，除了上调IL-9对于炎症的重新调节来促进RA愈合而不是抑制炎症外，大家也可以想象，在未来，ILC2可以作为一种循环使用的工具，来衡量炎症的愈合程度。[8]下一步研究可以怎么做？在ILC2中IL-9的产生调节机制依然不清楚。与IL-5和IL-13广泛表达于所有组织中的ILC2中不同，IL-9并不是一个普遍的特征，如皮肤的ILC2。[7]产生IL-9的T细胞及ILC2或其他上下游的表达，是否决定了IL-9的病原学或保护性功能，依然是未知的。因此，研究表达时机，系统性或局限性的效应，细胞接触依赖功能，以及确定IL-9通路（前有报道称IL-2可以诱导ILC2中的IL-9表达）的相关治疗靶点等，都对该研究的临床转化有着关键作用。[9]已知在IL-9缺陷小鼠和消退素(resolvin)缺陷小鼠中，关节炎症的愈合都是不稳定的。之前有报道，消退素脂氧素A4能够通过G蛋白偶联受体FPR2直接调节人ILC2功能，因此研究消退素是如何调节IL-9在ILC2中的产生也会很有意义。[7]目前后续的进一步研究?Soare,A.,Weber,S.,Maul,L.,Rauber,S.,Gheorghiu,A.M.,Luber,M.,Houssni,L.,Kleyer,A.,vonPickardt,G.,Gado,M.,Simon,D.,Rech,J.,Schett,G.,Distler,J.W.H.,Simon,D.().CuttingEdge:HomeostasisofInnateLymphoidCellsIsImbalancedinPsoriaticArthritis.TheJournalofImmunology,ji.高ILC2/ILC3比值与银屑病性关节炎缓解相关，进一步明确了ILC的稳态与疾病活动程度间的关系。?Düster,M.,Becker,M.,Gnirck,A.C.,Wunderlich,M.,Panzer,U.,Turner,J.E.().Tcell‐derivedIFN‐γdownregulatesprotectivegroup2innatelymphoidcellsinmurinelupuserythematosus.Europeanjournalofimmunology.在自身免疫性疾病中，以系统性红斑狼疮的狼疮性肾炎为例，ILC2量的减少与其进展相关。?Lai,D.,Tang,J.,Chen,L.,Fan,E.K.,Scott,M.J.,Li,Y.,Billiar,T.R.,Wilson,M.A.,Fang,X.,Shu,Q.,Fan,J.().Group2innatelymphoidcellsprotectlungendothelialcellsfrompyroptosisinsepsis.Celldeathdisease,9(3),.ILC2分泌IL-9，在肺炎中保护肺内皮细胞，避免其在败血症中坏死。?AbdElhalem,S.S.,Haggag,N.Z.,El-Shinnawy,N.A.().BonemarrowmesenchymalstemcellssuppressIL-9inadjuvant-inducedarthritis.Autoimmunity,51(1),25-34.骨髓间充质干细胞可降低佐剂诱导性关节炎的IL-9水平，提示间充质干细胞和抗氧化剂的联合治疗可有效减轻氧化应激，加强干细胞的免疫调节功能。参考文献[1]Rauber,S.,Luber,M.,Weber,S.,Maul,L.,Soare,A.,Wohlfahrt,T.,Lin,N.Y.,Dietel,K.,Bozec,A.,Herrmann,M.,Kaplan,M.H.().Resolutionofinflammationbyinterleukin-9-producingtype2innatelymphoidcells.Naturemedicine,23(8),.[2]Isom?ki,P.,Punnonen,J.().Pro-andanti-inflammatorycytokinesinrheumatoidarthritis.Annalsofmedicine,29(6),-.[3]Stamp,L.K.,James,M.J.,Cleland,L.G.().Paracrineupregulationofmonocytecyclooxygenase-2bymediatorsproducedbyTlymphocytes:roleofinterleukin17andinterferon-gamma.TheJournalofrheumatology,31(7),-.[4]Chabaud,M.,Lubberts,E.,Joosten,L.,vandenBerg,W.,Miossec,P.().IL-17derivedfromjuxta-articularboneandsynoviumcontributestojointdegradationinrheumatoidarthritis.ArthritisResearchTherapy,3(3),.[5]Hueber,A.J.,Asquith,D.L.,Miller,A.M.,Reilly,J.,Kerr,S.,Leipe,J.,…McInnes,I.B.().CuttingEdge:MastCellsExpressIL-17AinRheumatoidArthritisSynovium.TheJournalofImmunology,(7),LP-.[6]Hartigan-O’Connor,D.J.,Hirao,L.A.,McCune,J.M.,Dandekar,S.().Th17cellsandregulatoryTcellsinelitecontroloverHIVandSIV.CurrentOpinioninHIVandAIDS,6(3),.[7]Roediger,B.,Weninger,W.().Resolvingachronicinflammationmystery.Naturemedicine,23(8),.[8]Razzak,M.().inflammation:Resolving—ratherthansuppressing—inflammationinRamightbetheanswer.NatureReviewsRheumatology,13(9),.[9]Karagiannis,F.,Wilhelm,C.().MoreIsLess:IL-9intheResolutionofInflammation.Immunity,47(3),-.